Приготовление градиента

При использовании данного метода в центрифужной пробирке готовят градиент плотности, на который наслаивают исследуемый образец. В процессе центрифугирования частицы распределяются в градиенте плотности в соответствии с их размером и разницей в плотности частицы и среды.

Выбор вещества, используемого для приготовления градиента, зависит от целей исследования. При этом учитываются проницаемость данного вещества внутрь разделяемых структур, его влияние на структуру и функции исследуемых частиц, возможность получения необходимой плотности. На практике часто применяют растворы сахарозы, фиколла, декстрана или других высокомолекулярных соединений.

Градиент плотности может быть ступенчатым или непрерывным. При подготовке ступенчатого градиента плотности в центрифужную пробирку с помощью пипетки или шприца осторожно вносят несколько растворов с последовательно уменьшающейся плотностью. На верхний слой, обладающий наименьшей плотностью, наслаивают образец в виде узкой зоны. В результате получают дискретные зоны с различной плотностью. В ходе центрифугирования частицы распределяются между зонами в соответствии с их размерами и плотностью.

Для приготовления непрерывного градиента плотности, как правило, используют специальные установки, которые автоматически смешивают растворы разных концентраций в определенных количествах и подают их в центрифужные пробирки. Плавный линейный градиент удается также получить из ступенчатого градиента при длительном его стоянии, когда границы между зонами сглаживаются. Этот процесс можно ускорить, аккуратно перемешивая содержимое пробирки тонкой проволокой или слегка покачивая пробирку.